如何檢測養(yǎng)殖水體中的霍亂弧菌：養(yǎng)殖水體中的霍亂弧菌（v.cholerae）

摘要：養(yǎng)殖水體的衛(wèi)生狀況直接關(guān)系到動物的健康和生長。本文介紹了如何利用實驗室方法來檢測養(yǎng)殖水體中的霍亂弧菌（V. Cholerae），包括樣品采集、培養(yǎng)和鑒定等步驟。通過采樣技術(shù)獲取水體樣本，然后將其接種在選擇性培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)。通過形態(tài)學特征和生化反應(yīng)來確認霍亂弧菌的存在。這種方法不僅提高了養(yǎng)殖水質(zhì)監(jiān)測的準確性，也有助于及時采取控制措施，保障水生動物健康。

養(yǎng)殖水體中霍亂弧菌的檢測方法

一、傳統(tǒng)培養(yǎng)檢測法

1. 增菌培養(yǎng)
   • 稱取檢樣（如水體中的樣本或其他相關(guān)樣本）25g，加入裝有225mL堿性蛋白胨水(APW)的廣口瓶內(nèi)。如果是固體樣品應(yīng)以均質(zhì)器9000r/min - 10000r/min打碎，或以剪刀充分剪碎。然后在(36±1)°C培養(yǎng)6h - 8h和16h - 24h。若為牡蠣樣品，應(yīng)同樣制備另一份檢樣，置于APW中，42°C培養(yǎng)6h - 8h和16h - 24h。
2. 分離培養(yǎng)
   • 以3mm - 5mm接種環(huán)取6h - 8h和16h - 24h增菌培養(yǎng)液的表面生長物一環(huán)分別劃線接種于TCBS瓊脂平板至少各一個，于(36±1)°C培養(yǎng)18 - 24h。在TCBS瓊脂上，典型的霍亂弧菌菌落為大的，光滑，黃色，稍平，具有不透明中心和半透明的邊緣。
3. 初步鑒定
   • 用接種環(huán)挑取TCBS瓊脂平板上2 - 5個可疑菌落，劃線于T1N1瓊脂平板上，(36±1)°C培養(yǎng)12h - 18h。
   • 以無菌白色濾紙沾取T1N1瓊脂表面培養(yǎng)物，滴加氧化酶試劑進行氧化酶試驗。
   • 以無菌環(huán)取氧化酶陽性的培養(yǎng)物于0.5%去氧膽酸鈉液試劑滴中，進行粘絲試驗。
   • 以接種針取氧化酶和粘絲試驗陽性的培養(yǎng)物，接種TSI、KIA和AGS，穿刺底層并劃線斜面。
   • 以接種針取上項相同培養(yǎng)物接種T1N0和T1N3肉湯。
   • 將TSI、KIA、AGS、T1N0和T1N3肉湯于(36±1)°C培養(yǎng)18h - 24h。

二、膠體金法

1. 細菌處理
   • 通過高速離心或破壁等方法將水體中的細菌樣品處理，使其裂解釋放出胞內(nèi)物質(zhì)。
2. 反應(yīng)
   • 將處理好的樣品和標記有抗體的膠體金溶液混合，靜置反應(yīng)一段時間。
3. 分析結(jié)果
   • 觀察反應(yīng)混合物的顏色變化，判斷是否有霍亂弧菌樣品。這種方法操作簡單、迅速，能夠快速檢測到霍亂弧菌等靶向分子，但操作流程受質(zhì)量等因素影響較大，且檢測結(jié)果僅能表明有無靶向分子存在，無法鑒定分離出的細菌屬種和種類。

三、聚合酶鏈反應(yīng)法（PCR法）

1. 普通聚合酶鏈反應(yīng)法
   • 核酸擴增技術(shù)，即聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)，其基本原理是設(shè)計、合成兩條寡核苷酸，作為引物，對應(yīng)于待測病原微生物（霍亂弧菌）某一段特異性序列的兩端，然后在體外模擬DNA體內(nèi)復制的過程反復擴增，使靶序列放大上萬倍甚至上百萬倍而被檢測出來。一般選擇霍亂腸毒素(cholera enterotoxin，CT)基因ctx的保守序列作為靶基因。不過一些非產(chǎn)毒株（如環(huán)境來源的菌株）有可能通過基因水平轉(zhuǎn)移獲得毒力基因成為產(chǎn)毒株，若僅檢測ctx基因容易造成漏檢。因此，霍亂弧菌的其他重要基因，如毒力協(xié)同調(diào)節(jié)菌毛A基因(tcpA)、o抗原基因(rfb)、外膜蛋白基因(omp)以及毒力相關(guān)基因等也可作為檢測靶點進行綜合檢測。

四、雙重微滴數(shù)字PCR法（適用于貝類養(yǎng)殖水體相關(guān)檢測，對養(yǎng)殖水體中霍亂弧菌檢測有一定參考意義）

1. 原理
   • 本方法采用的微滴數(shù)字PCR技術(shù)是基于實時熒光PCR技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展而來的，而且靈敏度更高。通過對霍亂弧菌相關(guān)基因的特異擴增，來實現(xiàn)對霍亂弧菌的檢測。這種方法可以通過高通量技術(shù)來提高檢測速度，從而降低人工成本，解放勞動力。利用該方法還可以同時檢測貝類養(yǎng)殖水體中可能存在的副溶血性弧菌，并初步確認其比例，這對指導水產(chǎn)品加工企業(yè)進行進出口貿(mào)易，保證產(chǎn)品品質(zhì)具有重要的意義，同時也有助于對養(yǎng)殖水體整體的微生物污染情況進行評估。

霍亂弧菌快速檢測新技術(shù)

養(yǎng)殖水體微生物污染評估

貝類產(chǎn)品霍亂弧菌防控措施

PCR法檢測霍亂弧菌的優(yōu)缺點